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海藻糖酶(TREH)真核蛋白操作步驟

更新時間:2023-07-12      點擊次數:747

海藻糖酶(TREH)真核蛋白操作步驟:


Ⅰ 實體組織蛋白的提取


1. 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑, 1 μL蛋白酶抑制劑和 5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數分鐘待用。


2.  每100mg固體組織置于培養皿中,剪碎成3mm×3mm左右的小塊,加入0.5~1 mL冷 Lysis Buffer,玻璃勻漿器上下手動勻漿15次,注意低溫操作;


3. 取組織勻漿液轉移到1.5mL預冷的離心管,離心10000轉/分,4℃離心5 min;


4. 取上清轉移至新的預冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford法、BCA法);


5. 分裝保存于-70℃,避免反復凍融。


Ⅱ 培養細胞蛋白提取


1. 貼壁培養的細胞,吸去培養基后,加入10mL/150mm培養板的冷PBS洗兩次,每次振搖數次以盡量去除培養液;


2. 懸浮培養的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞,將細胞及培養液移至離心管中, 1000轉/分離心10 min,再用10mL/150mm培養板的冷PBS,1000轉/分離心5 min洗兩次;


3. 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制劑, 1μL蛋白酶抑制劑和5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數分鐘待用。


4. 細胞洗滌后,轉至新的預冷的離心管中,加入上述配制好的冷Lysis Buffer,加入量如下表所示:


細胞數量


Lysis Buffer加入量


107個


0.5 mL~1 mL


5×106個


0.2 mL~0.5 mL


5.置于4℃搖床平臺上,溫和振蕩15 min;


6. 14,000rpm,4℃離心15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford法、BCA法);


7. 分裝保存于-70℃,避免反復凍融


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